Парша на картошке почему

как лечить землю и сами клубни, как бороться с коростой

Большая гордость для всех заядлых огородников — осенью получить богатый и здоровый урожай. Но не всегда всё так гладко, множество различных грибков и инфекций могут серьёзно усложнить жизнь. Так, для картофеля злейший враг — парша. Она появляется в самый неподходящий момент и плохо поддаётся лечению во время роста корнеплода. Но ещё большая ошибка дачника — перепутать грибок с другим заболеванием, например, с истощением почвы и начать её активно подкармливать, тем самым создавая более благоприятные условия для размножения споров парши.

Короста на картофеле: от чего появляется и как выглядит

Парша — это грибок, появляющийся на клубнях картофеля. Наверное, это самое распространённое заболевание картошки, которое способно оставить без полноценного урожая.

Парша проявляется в виде тёмных корост на поверхности корнеплодов. При этом изначально появляются маленькие язвочки. Вылечить растение во время его роста практически невозможно. Поэтому процесс распространения грибка не останавливается, и форма болезни переходит в более масштабную.

Сбор урожая картофеля

К сведению! Заражённый картофель паршой не представляет никакой опасности здоровью человека. Поэтому он вполне пригоден в пищу, стоит лишь удалить все коросты с кожурой. Но при этом его вкусовые качества значительно отличаются от здорового урожая. Это неудивительно, ведь с развитием грибка в овоще уничтожаются полезные вещества и минералы, а также сокращается количество крахмала, поэтому даже для этих целей урожай становится непригодным к использованию.

Причины заражения

Этот грибок, как и многие другие, не только портит внешний вид, но и создаёт массу других проблем дачнику.

Если во время роста картофель заразился паршой, то это обязательно отразится на его вкусовых качествах, а также уменьшит срок хранения. Дело в том, что кожура истончается в местах, где короста на картофеле, из-за чего в корнеплод из почвы проникают бактерии, которые в дальнейшем размножаются, и начинается процесс гниения.

Грибок очень быстро распространяется, стоит заболеть одному кусту, как в скором времени заразятся все его соседи. Поэтому важно вовремя заметить признаки появления грибка и начать с ним борьбу.

Разновидность картофельной парши

Парша на картошке не возникает из ниоткуда, и её можно избежать, соблюдая некоторые правила:

нельзя сажать картофель на одно и то же место несколько лет подряд. В идеале стоит менять место посадки каждый год, но если этого не позволяет площадь земельного участка, то хотя бы каждые три года;
необходимо внимательно отбирать семенные клубни. Если попадётся хоть одна заражённая картофелина, болезни не избежать;
не стоит допускать переизбытка азота в почве на месте посадки. Но здесь уже ничего не поделаешь. Единственное, что можно сделать, так это своевременно начать удобрять почву после появления признаков грибка;
не нужно удобрять почву бездумно. В большинстве случаев заболевание возникает именно по причине неправильной подкормки;
нужно регулировать пониженную кислотность грунта в месте высадки картофеля. Опять же, если проявилось заболевание по этой причине, то необходимо правильно подобрать удобрения для повышения этого показателя;

нужно правильно хранить картофель. Важно уделить внимание температуре, вентиляции и влажности. Особенно это касается той партии урожая, что пойдёт на посадку весной.

Виды картофельной парши

Такой грибок, как парша, картофели не только неприятен, но и имеет несколько разновидностей. Ниже, о каждой из них подробнее. Ведь зная, какая именно парша на картошке, вопрос, как избавиться от нее, будет решен быстрее.

Обыкновенная картофельная парша

Парша обыкновенная проявляется светло-коричневыми язвами, которые переходят в большие коросты. Могут располагаться как на отдельном участке клубня, так и покрывать картофель полностью.

Картофельная парша обыкновенная

Обычно такого вида грибок появляется на картофеле из-за неправильной посадки. Нужно стараться не сажать клубни слишком высоко, иначе воздух не будет поступать к ним, что сократит риски заражения растения.

Кроме этого, многие вносят в грунт золу и известь для правильного дисбаланса и роста урожая. Главное тут, не переборщить с тем или другим ингредиентом подкорми, иначе это плохо скажется на картофеле.

При появлении на участке обыкновенная парша быстро охватывает целое картофельное поле. Её признаки выражены на клубнях и редко отображаются на кустах. Поэтому заметить заболевание во время роста кустов практически невозможно. Таким образом дачник рискует остаться к зиме совсем без урожая.

К сведению! Особенно подвержены заражению сорта картофеля с тонкой красноватой кожурой.

Избавляться от грибка можно начинать уже осенью. Самые эффективные способы, как бороться с паршой обыкновенной — это действовать от обратного. Если известно, что грибок хорошо размножается в земле с чрезмерным содержанием щелочи, но при этом с нехваткой таких химических элементов, как бор и марганец, то после того, как собрали урожай, следует внести в землю такое количество недостающих компонентов, чтобы споры грибка погибли.

Требуемые нормы удобрений указаны из расчёта на 100 м²:

сульфат аммония — 1,5 кг;
калимагнезия — 3 кг;
суперфосфат — 2-2,5 кг;
сернокислый марганец — 20-30 г;
борная кислота — 20-30 г;
сернокислая медь — 30-40 г.

Обратите внимание! Обработку земли стоит провести несколько раз: после сбора урожая и перед последующей посадкой.

Борьба с порошистой паршой картофеля

В отличие от парши обыкновенной, порошистая даёт о себе знать уже во время роста кустов. На стеблях появляются хорошо заметные очаги поражения в виде наростов, а на клубнях в это время размножаются споры грибка, поражая урожай белыми язвами, которые вскоре станут коричневыми.

Картофельная парша порошистая

Последствия порошистой парши картофеля, как и у всех — порча урожая, гниение клубней.

Данный вид спор заносится в почву с удобрением, навозом и другой подкормкой. Также причиной гибели урожая может стать уже заражённый картофель, который по случайности попал в землю при посадке. Слишком влажная почва из-за дождей или обильного полива — тоже не лучший друг картофеля. В мокрой земле быстро заводятся бактерии и начинают размножаться, переходя на картофельные клубни.

Важно! Ни в коем случае нельзя использовать шелудивый картофель в качестве семян.

Черная картофельная парша

Чёрная картофельная парша — ризоктониоз. Эта зараза начинает своё распространение с верхних листьев куста. С одной стороны, это даже хорошо, так как сразу видны неполадки с растением, а значит, можно предпринять меры по лечению.

Черная картофельная парша

Отличается грибок не только методом заражения, но и внешним проявлением. Это не классические болячки и язвы, а рыхлые пятна тёмно-коричневого цвета, переходящие чуть ли не в чёрный. Они напоминают прилипшую грязь. Сразу и не поймёшь, что это признаки заболевания, а ведь картофель необходимо спасать в срочном порядке.

Обратите внимание! При наличии паразитного грибка картофель не будет покрываться целиком болячками, а лишь небольшими участками в 5-6 мм. Но, несмотря на это, болезнь способна полностью уничтожить куст на сроках его зарождения и ранних стадиях развития или просто не дать вырасти полноценным клубням.

При пережитом во время роста заболевании урожай может храниться недолго. Чёрная парша не развивается так стремительно в гниль, как это делают родственные ей грибки. Но, тем не менее, вкусные качества картофеля будут уже не те.

Чем раньше обнаружится чёрная парша картофеля, тем раньше можно приступить к её лечению, что позволит спасти урожай в будущем. А это сделать достаточно просто, так как развитие новообразований становятся заметны ещё на первых стадиях.

За несколько недель до того, как планируется приступить к сбору урожая, нужно скосить ботву. Так кожура корнеплода окрепнет, и будет больше шансов, что урожай долежит до весны.

В следующем году, перед посадкой нужно удобрить почву раствором сульфата аммония (2 г на ведро воды), а также хорошенько полить кусты в период их цветения.

Ну и, конечно же, стоит убедиться в пригодности семян к посадке, чтобы не допустить попадания заражённых клубней.

Серебристая картофельная парша

Серебристая картофельная парша сразу поражает клубни кустов, при этом иссушая ботву, из-за чего в скором времени гибнет весь куст.

Серебристая картофельная парша

Название болезни говорит само за себя — на картофеле образуются характерные пятна серо-серебристого цвета с неровными краями. На ранних стадиях заражения появляются тёмные болячки, чем-то похожие на сажу из костра. Но через время коросты отслаиваются и начинают выглядеть как крупные серебристые шрамы.

Так же, как и в остальных случаях заражения, хранится картофель недолго. Хоть в результате отсутствует гниль, зато картофель быстро становится дряблым и уменьшается в размерах.

Наверное, это самая коварная разновидность заболевания, так как возбудитель грибка активно развивается при сильной влажности и невысокой температуре воздуха, примерно около 4 °С. Это означает, что даже при хранении бактерии способны размножаться и заразить здоровый урожай. Поэтому при выкапывании стоит быть предельно внимательным и не отправлять в хранилище заражённый картофель.

Обратите внимание! В почву споры чаще всего попадают с уже заражёнными ранее семенами. Пик заражения проявляется в момент цветения и когда начинают зарождаться клубни.

Лучшее воздействие на серебристую паршу — это готовые химические препараты. Часто опытные огородники используют для борьбы с картофельной паршой:

нитрафен;
титусим;
ботран.

На упаковке средства подробно написано, в каких пропорциях разводить его и как правильно обработать семена картофеля перед посадкой.

Профилактические меры по предотвращению заболевания

Как говорилось ранее, даже поражённый болезнью овощ вполне пригоден к употреблению в пищу. Наверное, это и есть причина, почему многие садоводы не придают особого значения и отказываются применять какие-то препараты против грибка, считая это лишней тратой времени. Но лечить растения и почву вместе с ним всё же нужно, иначе картофель просто лишается своих полезных свойств. Если не лечить паршу, то последующие урожаи будут точно так же заражены. А откуда взяться здоровым кустам, когда они были посажаны из прошлогодних больных семян?

Обработка почвы перед посадкой — важная процедура, которой пренебрегают многие огородники

Так какие действия предпринимать, чтобы не возникала парша на картофеле, как лечить землю?

Самый простой эффективный народный метод избавиться от парши — это оставить заражённый участок земли в покое на ближайшие 5 лет. Просто не высаживать ничего в грунт на месте бывшего сбора картофеля, особенно это касается растений из семейства Паслёновых. К такому виду растений относятся томаты, баклажаны, перец, физалис. Но даже морковь способна заразиться грибком, поэтому лучше не рисковать.

Агротехники считают, что парша способна к вымиранию за определённое количество времени. Но что делать, когда площадь земли не позволяет так бездумно распоряжаться квадратами? Тогда рекомендуется воспользоваться методом принудительного уничтожения парши. Поле, где раньше рос картофель, густо засевают бобовыми, злаковыми или горчицей. Воздействие этих растений на землю сыграет положительную роль. Как только трава взошла на 15-20 см выше земли, почву перекапывают, смешивая её с лечебной зеленью.

Обратите внимание! Такой способ борьбы с паршой использовали ещё прабабушки, а значит, он действительно эффективен.

Следующей весной, перед тем как высадить семена картофеля, желательно повторить процедуру. Вместо того, чтобы засевать поле бобовыми растениями, можно обильно пролить землю раствором из воды и горчичного порошка, а для большего результата посыпать порошков грунт, после чего спокойно приступать к посадке.

Также на рынках и в садоводческих магазинах достаточно специальных готовых средств для лечения и профилактики различных видов грибков.

Из всего сказанного напрашивается вывод, что не стоит пренебрегать значительностью любых заболеваний растений. Но в качестве лучшей профилактики, стоит выбирать картофель, устойчивый к парше и многим другим недугам.

Картофельная парша - Парша обыкновенная в картофеле

Хорошая новость о картофельной парше в том, что она обычно выглядит хуже, чем есть на самом деле. Струпья или галлы представляют собой выступающие кратерообразные пятна на коже клубня с неровными краями. Иногда всего несколько, но в тяжелом случае они закрывают кожу. Мякоть же поражается редко, и после очистки картофель вполне съедобен.

Парша картофеля обыкновенная

Причина парши картофеля

Возбудителем парши картофеля является бактерия Streptomyces Scabies , обнаруженная в почве.Чаще всего встречается на легких песчаных почвах с низким содержанием органических веществ.

Почвы, которые ранее были пастбищами, особенно подвержены заболеванию.

Почвы с высоким pH (недавно известковые) обеспечивают лучшую среду для бактерий. Сухие условия в первые шесть недель после посадки также способствуют образованию парши картофеля.

Как предотвратить и контролировать паршу картофеля

В отличие от большинства других овощей, предпочитающих pH, близкий к нейтральному (7.00) картофель лучше всего выращивать в почве с pH 5,5, которая препятствует появлению бактерий Streptomyces Scabies и, следовательно, парши. Внесение удобрений сульфатом аммиака или суперфосфатом приводит к подкислению почвы, и его следует учитывать при использовании известковых почв с естественно высоким pH. Не извлекайте почву перед посадкой картофеля, если pH почвы не очень низкий, ниже 5,00.

Избегайте чрезмерного использования азотных удобрений, таких как сульфат аммиака, поскольку чрезмерное внесение азота задерживает начало набухания клубней, что продлевает период восприимчивости растения к парше.

Повышение уровня органических веществ в почве и, таким образом, удержание влаги в почве в сочетании с регулярным поливом, в идеале каждый день в течение первых шести недель после посадки, также уменьшит тяжесть симптомов. Сохранение кожуры семенных клубней во влажном состоянии останавливает распространение болезни

Севооборот также поможет в борьбе с паршей картофеля. Выращивание картофеля на одном и том же месте в течение нескольких лет приведет к увеличению уровня бактерий в почве. Имейте в виду, что редис, свекла, репа, морковь и красный клевер могут переносить паршу.

Домашние производители не имеют средств химического контроля.

Устойчивые к парше картофеля сорта

Если обычная картофельная парша является постоянной проблемой на вашем участке, рассмотрите возможность выращивания устойчивых сортов картофеля в дополнение к методам борьбы, описанным выше. К устойчивым сортам картофеля относятся:

Акцент
Анна
Аня
Арран Пилот
Avondale
Балморал
Банба
Камелот
Кара
Карлингфорд
Карнавал
Челленджер
Часки
Шопен
бордовый
Космос
Курлан

Друид
Электра
Элли
Галактика
Золотое чудо
Хабиби
Инка Белла
Рассвет инков
Шут
Король Эдвард
Ла Страда
Леди Кристл
Lanorma
Лулу
Малин
Манхэттен

Золото майя
Королева майя
Сумерки Майя
Мелодия
Mimi
Морене
Надин
Оркестр
Пару
Пентланд Корона
Пикассо
Piccolo Star
Pink Gypsy
Pizazz
Русет Бербанк
Сатурна
Саванна

Избегайте посадки сортов, очень чувствительных к парше обыкновенной
как:

Посол
Голубой Дунай
Герцог Йоркский
Эмма
передовой
Горизонт
Леди Клэр

Марис Пайпер
Максин
Звезда Майя
Mistay
Мустанг
Пантера
Красный герцог Йоркский
Рудольф

Сетанта
Шелфорд
Комета Смита
Spunta
Тресдейл
Ольстер Чифтен
Актуальный
Зоар

Товары для выращивания картофеля

См. Также:

Frontiers | Биологический контроль парши картофеля с помощью редкого соединения изатрополона С, продуцируемого Streptomyces A1RT

, способствующим росту растений

Введение

Парша обыкновенная (CS) - это рецидивирующее заболевание растений, встречающееся во всем мире (Loria et al., 1997). Это вызвано грамположительными нитчатыми видами Streptomyces отряда Actinomycetales. Две трети известных антибиотиков производятся Actinomycetes и 80% этих антибиотиков производятся Streptomyces spp.(Ahmad et al., 2017; Wang et al., 2017). В рамках рода Streptomyce некоторые виды могут быть патогенами растений, например Streptomyces scabies , вызывающими CS картофеля. Основными возбудителями CS являются Streptomyces scabies, S. acidiscabies, S. turgidiscabies, S. europaeiscabiei и другие представители, в том числе S. botropensis, S. stelliscabiei и S. aureofaciens (Lambert 1989; Miyajima, et al., 1998; Leiminger et al., 2013). Эти разные виды сгруппированы вместе из-за их разной распространенности, фенотипических и генотипических признаков, и они вызывают сходные признаки и симптомы с аналогичными хозяевами (Loria et al., 1997).

Патогенные признаки этих видов регулируются фитотоксином растений, такстомином. Преобладающей формой такстомина, продуцируемого S. scabies , является такстомин А. Биосинтез такстомина А стимулируется целлобиозой и целлотриозой растений (Johnson et al., 2007). Генотипически продукция тахстомина А кодируется генами нерибосомной пептид синтетазы [ txtA и txtB ( txtAB )] и геном монооксигеназы цитохрома P-450 ( txtC ) (Healy et al., 2002). Гены txtAB являются детерминантами патогенности, но другие гены, такие как nec1 и tomA , способствуют или усиливают патогенность, хотя они не являются абсолютно необходимыми (Kreuze et al., 1999; Healy et al., 2000; Flores-González et al., 2008; Barry et al., 2012).

Использование бактериальных штаммов для подавления CS зависит от многих факторов, включая взаимодействие между антагонистами и патогенами, условия окружающей среды, экологическую и эволюционную динамику антагонистических штаммов (Kinkel et al., 2012). Использование более высоких плотностей антагонистов Streptomyces согласуется с подавлением болезни CS (Wanner, 2007) за счет комплементарности антибиотиков Streptomyces . Экологические стрессы, такие как pH почвы, влажность и температура, могут варьироваться на разных полях или даже в пределах одного поля, в одно и то же или в разные сезоны. Эффективность одного и того же антагониста может варьироваться от сезона к сезону на одних и тех же или даже разных полях (Превост и др., 2006).Некоторые сорта картофеля более чувствительны к патогенам CS, и их трудно контролировать, потому что их адаптивность к содержанию S. scabies выше по сравнению с штаммом-антагонистом (Neeno-Eckwall et al., 2001).

Существует давний интерес к использованию бактерий, способствующих росту растений, в качестве стратегии устойчивого сельского хозяйства (Шеннан, 2008). Использование естественных или измененных микробных сообществ, которые подавляют фитопатогены, не только может снизить влияние болезней, но и снизить потребность в химических веществах, таких как пестициды и фунгициды (Emmert and Handelsman, 1999).В природе растения получают выгоду от симбиотических бактерий, которые противодействуют патогенам и, таким образом, подавляют рост болезней в растении (Lorang et al., 1995). PGRP ориентирован на использование в качестве средства биологической борьбы из-за полезных свойств, которые включают производство биоактивных соединений (Samac et al., 2003) и вторичных метаболитов, включая антибиотики, инсектициды и пестициды (Berdy, 2005). Кроме того, бактерии, способствующие росту растений, усиливают рост растений, производя фитогормоны, такие как ауксины (Lee et al., 2004), сидерофоры (Ryan et al., 2008) и путем активации защитных путей растений (Lin et al., 2012).

В прошлом микроорганизмы показали хороший потенциал в качестве бактерий, способствующих росту растений, для увеличения роста и урожайности риса (Lucas et al., 2009), пшеницы (Majeed et al., 2015), бобов (Perez-Montano et al. ., 2014), кукурузы (Qaisrani et al., 2014) и сои (Cassán et al., 2009). Но ограниченные данные доступны для стимуляции роста (Abbas et al., 2014) и подавления болезней (Kobayashi et al., 2015) в картофеле. Streptomyces spp. были описаны как бактерии, способствующие росту растений, благодаря положительному эффекту сопротивления патогенам (Neeno-Eckwall et al., 2001), продуцирующим литические ферменты (Prapagdee et al., 2008), сопротивляющимся воздействию окружающей среды (Coombs and Franco, 2003) и секретируют сидерофоры и фитогормоны (Berg, 2009; Khamna et al., 2009), которые полезны при взаимодействии с ризосферой растений (Khamna et al., 2009).

В настоящем исследовании патогены CS картофеля были выделены в Пенджабе, Пакистан.Антагонистические бактериальные штаммы были изолированы с картофельного поля без истории CS за последние 5 лет. Было высказано предположение, что такие поля могут содержать микроорганизмы, которые ускоряют рост растений и помогают подавлять болезни посевов картофеля. С этой целью было проведено исследование по выделению и характеристике патогенов CS картофеля. Также был проведен отбор образцов для выделения штаммов антагонистов бактерий. Мы описали потенциал Streptomyces A1RT как стимулятора роста растений и подавления болезни CS в посевах картофеля.Насколько нам известно, это первый отчет о биоконтроле против четырех основных патогенов CS.

Материалы и методы

Сбор образцов, выделение и идентификация бактерий

CS-инфицированных клубней картофеля были собраны в Исследовательском институте картофеля (PRI), Сахивал, Пакистан. Образцы картофеля были переданы на факультет микробиологии и молекулярной генетики Пенджабского университета в Лахоре, Пакистан. Образцы были классифицированы в соответствии с серьезностью их заболевания как очень низкая, низкая, умеренная, умеренно высокая, высокая и очень высокая в зависимости от процента 10, 20, 40, 60, 80 и 90% симптомов CS, соответственно.

Было обработано четырнадцать образцов картофеля с различными симптомами CS. Все образцы картофеля промывали стерильной дистиллированной водой, а затем дезинфицировали 2,8% -ным раствором гипохлорита натрия (NaOCl) с последующим трехкратным промыванием стерильной дистиллированной водой. Поражения, покрытые коркой, осторожно срезали стерильным скальпелем и гомогенизировали с 2 мл Трис-HCl (pH 7,2) в пробирке Эппендорфа с последующей инкубацией в течение 10 минут при 50 ° C в инкубаторе. Гомогенизированную смесь дополнительно разбавляли три раза Трис-HCl (pH 7.2). Для каждой аликвоты 100 мкл разбавленного образца наносили на чашки с агаром с дрожжевым солодовым экстрактом (YME) (Meng et al., 2011) и инкубировали при 28 ° C в течение 7 дней. Отобранные отдельные бактериальные колонии распределяли на другой чашке с агаром YME, и для каждого Streptomyces spp регистрировали признаки физического роста. Десять бактериальных изолятов, имеющих Streptomyces -подобных признаков роста, были выделены и очищены на дополнительных чашках с агаром YME. Эти Streptomyces spp. были идентифицированы на основе типичных признаков роста, диффузных пигментов и цвета спор по сравнению с уже идентифицированными Streptomyces spp.(положительный контроль любезно предоставлен доктором Юргеном Леймингером, Фрайзинг, Германия).

Для выделения антагонистических бактериальных видов были собраны образцы почвы с картофельного поля, которое имело очень низкий или нулевой уровень CS картофеля за последние 5 лет. Бактериальные виды, продуцирующие антибиотики, особенно Streptomyces spp., Были выбраны в качестве потенциальных антагонистов CS (Kharel et al., 2005).

Экстракция ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Для экстракции ДНК отобранные колонии Streptomyces выращивали в бульоне YME в течение 5 дней при 28 ° C.Каждую культуру центрифугировали, а осадок подвергали экстракции ДНК с использованием набора для очистки геномной ДНК Gene-JET (Thermo Scientific, США). Выделенную ДНК количественно определяли по поглощению при 260 нм (NanoDrop, Thermo Scientific, США). Образцы ДНК высокого качества (соотношение A ₂₆₀ / A ₂₈₀ составляло 1,7) подвергали амплификации ПЦР с использованием универсальных праймеров 16S рРНК (Edwards et al., 1989) для характеристики Streptomyces spp.Каждая реакция ПЦР содержала 1 мкл ДНК-матрицы, 2,5 мкл буфера для ПЦР (MgCl ₂), 1 мкл ДНК-полимеразы Taq , 1 мкл 2 мМ dNTP, 1 мкл 10 пмоль каждого праймера и 18,5 мкл H ₂ O to дают общий объем 25 мкл. ПЦР-амплификацию выполняли в BioRad Thermocycler, США. Реакцию ПЦР проводили с начальной денатурацией при 94 ° C в течение 3 минут с последующими 35 циклами денатурации при 94 ° C в течение 20 с, отжигом при 60 ° C в течение 30 с и удлинением при 72 ° C в течение 40 с.После цикла было выполнено окончательное удлинение при 72 ° C в течение 3 минут.

Для идентификации штаммов Streptomyces использовали видоспецифические праймеры для S. scabies (Lehtonen et al., 2004), S. turgidiscabies, S. acidiscabiei (Tagawa et al., 2008), S. europaeiscabiei, S. stelliscabiei и S. botropensis (Wanner, 2006). Область внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) 16S-23S была амплифицирована с использованием пары праймеров ITS-F и ITS-R (Song et al., 2004). Ампликон расщепляли Hpy99I (New England Biolabs), который разрезал сайт ITS в положениях нуклеотидов 1629-1633. Затем образец рестрикции визуализировали с помощью гель-электрофореза. Продукты ПЦР были секвенированы GACT, Германия. Последовательности 16S рРНК были представлены в Европейской базе нуклеотидов EMBL с номерами доступа KU560917, LN908787 и LN908789.

Идентификация острова патогенности

Праймеры

для полимеразной цепной реакции были разработаны для определения острова патогенности (PAI) чувствительных патогенных штаммов Streptomyces .ПЦР-амплификацию проводили с использованием гена txtAB , гена tomA (Wanner, 2006) и гена nec1 (Bukhalid et al., 1998). ПЦР выполняли в условиях, описанных выше, за исключением того, что температура отжига была установлена как 48 ° C, 55 ° C и 60 ° C для генов txtAB, tomA и nec1 соответственно. Все идентифицированные гены депонированы в NCBI под номерами доступа KX842598-606.

Анализ ингибирования бактерий

Для проверки антибактериальной активности антагониста Streptomyces spp.против патогенного CS, вызывающего штаммов Streptomyces , был проведен диско-диффузионный анализ (CLSI, 2015). Двенадцать Streptomyces spp. выращивали отдельно в бульоне YME в течение 5–7 дней при 28 ° C во встряхиваемом инкубаторе. Аликвота 100 мкл патогенных Streptomyces spp. Культуру распределяли в виде газона на чашки с агаром YME с помощью чашек для посева Rattler ^TM (Zymo Research Сотрудничество, США). После сушки планшетов использовали отдельные диски из фильтровальной бумаги для поглощения 25 мкл экстракта МеОН из каждого антагонистического изолята Streptomyces .Затем фильтрующие диски наносили на чашки с агаром YME, которые затем помещали в инкубатор при 28 ° C на 3 дня в вертикальном положении. После инкубации зоны ингибирования вокруг фильтровальных дисков регистрировали в миллиметрах (мм). Для подтверждения антибактериальной активности фракций, содержащих изатрополон С, анализ ингибирования бактерий проводили с использованием изатрополона С, растворенного в метаноле.

Производство и анализ индол-3-уксусной кислоты с помощью HPLC-DAD-MS

Для определения потенциала антагонистических изолятов Streptomyces как организмов, способствующих росту растений, колориметрическую оценку ИУК проводили, как описано Гордоном и Вебером (1951).Бактериальные штаммы выращивали в трех повторностях в течение 5–7 дней при 28 ° C, 180 об / мин в жидкой среде ISP-2 с добавлением 500 мкг мл ^-1 L-триптофана (стерилизовано фильтрованием). После инкубации культуру центрифугировали при 14000 об / мин в течение 15 мин. Один миллилитр супернатанта смешивали с 2 мл реагента Сальковского (приготовленного путем добавления 1 мл 0,5 М FeCl ₂ к 50 мл 35% хлорной кислоты) и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение получаса. Появление розового цвета наблюдалось как индикатор продукции ИУК.Оценка ИУК выполнялась путем измерения оптической плотности при 535 нм (Увикон 933). Строили стандартную кривую для ИУК, и титр ИУК выражали в мкг мл ^-1.

Производство индол-3-уксусной кислоты также определяли с помощью ВЭЖХ-ДАД-МС. Супернатанты культур, полученные, как описано выше, подкисляли до pH 2,5 с помощью 1 н. HCl и дважды экстрагировали равным объемом этилацетата. Органическую фазу упаривали в вакууме и полученный порошок повторно растворяли в 5 мл МеОН. Анализ ВЭЖХ выполняли на системе Agilent 1100, оснащенной детектором с диодной матрицей и квадрупольным детектором массы.Неочищенный метанольный экстракт ИУК разбавляли в 10 раз и вводили 20 мкл в колонку XBridge C18 с обращенной фазой (3,5 мкм, 100 мм × 4,6 мм), уравновешенную смесью 95: 5 метанол / вода. Экстракт разделяли изократически при скорости потока 0,5 мл мин. ^-1. Время удерживания ИУК определяли путем сравнения со стандартным образцом (Sigma-Aldrich).

Производство и анализ вторичных метаболитов с помощью HPLC-DAD-MS

Антагонистические штаммы культивировали во встряхиваемых колбах объемом 500 мл, содержащих 150 мл среды TSB, в течение 24–48 ч при 28 ° C, 180 об / мин.Десять миллилитров этой прекультуры использовали для инокуляции 150 мл среды YME и инкубировали в течение 3-5 дней в тех же условиях. После культивирования клетки удаляли центрифугированием, а супернатант культуры дважды экстрагировали 100 мл этилацетата. После концентрирования в вакууме экстракт растворяли в метаноле и использовали для анализа HPLC-DAD-MS. Условия ВЭЖХ были идентичны тем, которые использовались для анализа ИУК.

Очистка и структурное выяснение Isatropolone C

Предварительное культивирование TSB объемом 100 мл Streptomyces sp.A1RT использовали для инокуляции 10 мкл YME, который затем инкубировали в течение 3 дней при 28 ° C, 180 об / мин. После инкубации клетки удаляли центрифугированием и супернатант дважды экстрагировали равным объемом этилацетата. Растворитель упаривали в вакууме, получая порошок. Ацетилирование проводили уксусным ангидридом и пиридином. Сто миллиграммов порошкообразного экстракта ресуспендировали в 1 мл пиридина в двугорлой круглодонной колбе при непрерывном перемешивании. Колбу продували азотом и через шприц по каплям добавляли 100 мкл уксусного ангидрида.Реакции давали возможность протекать в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего реакционную смесь концентрировали в вакууме. Полученный порошок повторно растворяли в 5 мл метанола и наносили на картридж Oasis ^® HLB20 35 см 3 (6 г). Картридж элюировали ступенчатым градиентом метанола от 20 до 100%. Каждую фракцию анализировали с помощью ВЭЖХ-ДАД-МС. Фракции, содержащие ацетилированный изатрополон C, концентрировали в вакууме.

Ацетилированный изатрополон C дополнительно очищали полупрепаративной ВЭЖХ (Agilent Technologies) с использованием Zorbax B-C18 (9.4 мм × 150 мм) предколонку и основную колонку Zorbax B-C18 (9,4 мм × 20 мм). Концентрированный раствор сырого соединения в метаноле наносили на колонку и элюировали ацетонитрилом / 0,5% уксусной кислотой в качестве буфера A и водой / 0,5% уксусной кислотой в качестве буфера B при скорости потока 2 мл мин ^-1. Очищенный ацетилированный изатрополон C растворяли в CD ₃ OD и анализировали с помощью ¹ H-ЯМР (400 MH _Z) и ¹³ C-ЯМР (100 MH _Z) на спектрометре Bruker DRX-500 ( Bruker, Карлсруэ, Германия).2D-ЯМР (¹ H / ¹ H-COSY, HMQC и HMBC) и МС высокого разрешения также использовали для подтверждения структуры соединения.

Тест на патогенность клубней картофеля

Патогенность выделенных Streptomyces по отношению к клубням картофеля была протестирована, как описано Wanner (2006). S. europaeiscabiei штамм G1 использовали в качестве положительного контроля (любезно предоставлен доктором Юргеном Леймингером, Фрайзинг, Германия). Для подтверждения нормального характера роста клубней картофеля также использовали один контроль без какой-либо бактериальной инокуляции.Изоляты Streptomyces инокулировали в 100 мл бульона YME в 250 мл колбы и помещали в инкубатор с встряхиванием при 28 ° C, 180 об / мин на 5-7 дней до тех пор, пока они не достигли концентрации 10 ⁶ КОЕ мл ^-1. Каждую культуру центрифугировали при 10000 об / мин в течение 2 минут для сбора клеток. Осадок клеток ресуспендировали в 100 мл стерильной дистиллированной воды ^-1 для получения вермикулита. Горшки среднего размера (8 л) заполняли подложкой из автоклавированного Compo Sana Universal ^® (Munster, Германия).Добавляли 100 мл инокулята вермикулита и равномерно распределяли в каждом сосуде, заполненном субстратом, в трех повторностях. Поверхность клубней картофеля стерилизовали 0,5% -ным отбеливателем в течение 10–15 мин и промывали стерильной водой. Картофель выращивали в теплице дважды: один раз в сентябре 2015 года и второй раз в марте 2016 года. Средняя температура составляла 22–25 ° C. Растения поливали по мере необходимости и постоянно следили за ростом. Через 3 месяца клубни потомства собирали, взвешивали и регистрировали длину побегов и корней.Клубни также оценивали на наличие болезней. Патогенный Streptomyces spp. снова были выделены из инфицированных очагов в собранных клубнях, чтобы подтвердить источник CS.

Статистический анализ

Статистический анализ выполнялся с использованием программного обеспечения SPSS (IBM SPSS Statistics, версия 21). Данные были собраны в трех экземплярах и подвергнуты однофакторному дисперсионному анализу (ANOVA). Сравниваемые средние значения были разделены методом множественного диапазона Дункана (DMRT). Значения p <0.05 считались статистически значимыми.

Результаты

Идентификация и молекулярная характеристика Streptomyces видов, вызывающих CS

Из десяти Streptomyces spp. выделено из инфицированных CS клубней, семь CS-вызывающих Streptomyces spp. были идентифицированы на основе анализа 16S рРНК с использованием специфических праймеров, разработанных для различных видов CS (дополнительная таблица S1). Два изолята были идентифицированы как S. scabies , четыре - как S.turgidiscabies и один как S. stelliscabiei . Два изолята S. scabies отличались от S. europaeiscabiei по наличию сайта рестрикционного фермента Hpy99I в области 16S-23S ITS последовательностей 16S рРНК (Flores-González et al., 2008).

Полимеразная цепная реакция была использована для идентификации генов в изолятах, которые кодируют патогенность. Семь из десяти изолятов Streptomyces , представляющих S.scabies, S. turgidiscabies и S. stelliscabiei , подвергали ПЦР с использованием праймеров для амплификации гена txtAB . Помимо гена txtAB , с помощью ПЦР-амплификации были обнаружены генов nec1 и tomA (рисунки 1A – C). Ни nec1 , ни tomA не были обнаружены в txtAB -отрицательных изолятах Streptomyces , но оба гена присутствовали среди всех txtAB -положительных изолятов Streptomyces .Инвентарные номера приведены в дополнительной таблице S2.

РИСУНОК 1. Обнаружение ПЦР генов, связанных с патогенностью CS, в семи изолятах Streptomyces . Показаны гели для электрофореза в агарозе с амплификацией ПЦР-реакций (A) txtAB ; (B) nec1 ; (C) tomA . Название каждого изолята (G1, AC46, AC56, AC80, AC81, AC82, AC83) показано над соответствующими полосами гелей.

Streptomyces A1RT, который проявляет активность против S. scabies (см. Ниже), не дал положительного результата на txtAB, nec1 и tomA с помощью ПЦР, что указывает на то, что этот штамм не является патогенным и, следовательно, не производят такстомин А.

Выделение штаммов Streptomyces , обладающих активностью против S. scabies , и выделение изатрополона А

Из почвы было выделено

штаммов Streptomyces, проявляющих активность против S.чесотка. Из двенадцати антагонистических штаммов Streptomyces экстракты семи штаммов показали биологическую активность (зона ингибирования варьировалась от 6 до 26 мм) (дополнительная таблица S3). Наивысшая активность экстракта (26 мм) против S. scabies была получена из Streptomyces A1RT (дополнительная таблица S3 и рисунок 2). Экстракт Streptomyces A1RT был также активен против S. turgidiscabies и S. stelliscabiei (данные не показаны).

РИСУНОК 2. Ингибирование S. scabies с помощью диско-диффузионного анализа. S. scabies штамм AC46 выращивали на планшете с твердой средой в присутствии фильтровальных бумажных дисков, содержащих (A) очищенный изатрополон C, растворенный в метаноле. (B) Неочищенный экстракт Streptomyces A1RT (C) Только метанол.

Двенадцать штаммов также были проанализированы на их способность продуцировать ИУК. Лучший продуцент, Streptomyces A1RT, продуцировал ИУК в концентрации 26 мкг / мл ^-1 после 4 дней инкубации при 28 ° C.Продукция была подтверждена анализом экстракта ВЭЖХ (фиг. 3).

РИСУНОК 3. ВЭЖХ-хроматограмма экстракта из Streptomyces A1RT. Показан пик индол-3-уксусной кислоты (ИУК). Время удерживания пика идентично стандартному образцу индол-3-уксусной кислоты.

Один видный метаболит, продуцируемый Streptomyces A1RT, был выбран для очистки и структурной характеристики. Посредством целевого массового фракционирования был выделен аморфный порошок от темно-желтого до оранжевого цвета, который проявил антибиотическую активность.Молекулярная формула была предсказана как C ₂₄ H ₂₄ O ₁₀ с помощью МС высокого разрешения (дополнительный рисунок S1) на основе наблюдаемого молекулярного иона [M-H] ^-; с m / z 471,1302 (рассчитано для C ₂₄ H ₂₄ O ₁₀, m / z 471,1302), что соответствует индексу дефицита водорода 13

Из-за нестабильности этого соединения во время очистки неочищенные экстракты ферментационного бульона подвергали глобальному ацетилированию для защиты предполагаемых реакционноспособных гидроксильных групп в молекуле (Yu et al., 2012). Моноацилированная молекула с m / z 513,2 ([M-H] ^-) была обнаружена в экстракте, который был выделен с помощью последовательности хроматографических стадий с получением 5 мг очищенного соединения. Одно- и двумерные данные ЯМР-спектроскопии (дополнительная таблица S4 и дополнительные рисунки S3 – S7) для соединения соответствовали O -ацилированному производному недавно описанного Isatropolone C (рисунок 4) (Cai et al., 2017) . Спектр поглощения (дополнительный рисунок S2) показал отчетливые максимумы при 300–350 нм и очень напоминал спектр, описанный для изатрополона A (Cai et al., 2017).

РИСУНОК 4. Химическая структура ацетилированного изатрополона C.

Стимуляция роста и подавление заболеваний CS с помощью Streptomyces

Три изолята Streptomyces (AC46, AC56 и AC80) вызвали поражения CS на поверхности картофеля, тогда как для клубней, зараженных комбинацией патогенов и антагонистического бактериального штамма, не было обнаружено никаких наблюдаемых симптомов CS (рис. 5). Симптомы CS варьировались от поверхностных до глубоких рубцов с ямками и выступающих повреждений CS.Для расчета степени тяжести заболевания был установлен индекс тяжести заболевания (DS) в диапазоне от 0 до 500, как описано Wanner (2009). Все протестированные организмы с индексом DS выше 20 считались патогенными (Wanner, 2009). Индекс DS тестовых штаммов составлял 102, 57, 107 и 58 для штаммов S. europaeiscabiei G1, AC46, AC56 и AC80 соответственно. Индекс DS был значительно ( p <0,05) снижен до 14,7, 1,8, 4,7 и 1,4 для штаммов G1, AC46, AC56 и AC80, соответственно, при использовании в комбинации с Streptomyces A1RT (рисунок 6).Индекс DS составлял 0 для клубней, подвергшихся воздействию Streptomyces A1RT, и 2,3 для незараженных клубней.

РИСУНОК 5. Клубни картофеля, собранные из горшечной почвы, обработанной штаммами Streptomyces (A) AC46; (B) AC56; (C) AC80; (D) A1RT + AC46; (E) A1RT + AC56; и (F) A1RT + AC80.

РИСУНОК 6. Графическое представление индекса серьезности заболевания, рассчитанного после сбора урожая.Планки погрешностей представляют стандартную ошибку. Результаты показаны в трех экземплярах ( p <0,05).

Потенциал стимуляции роста

оценивали по относительному увеличению массы клубней, развитию корней и побегов у растений, подвергшихся воздействию Streptomyces A1RT, по сравнению с растениями, подвергавшимися только воздействию патогенов CS. Например, когда клубни инокулированы патогенами CS, средний вес клубней был измерен как 40 г, который значительно ( p <0,05) увеличился до 60 г при использовании в сочетании с Streptomyces A1RT.Аналогичным образом, увеличение длины побегов и корней в среднем на 5–10 см (рис. 7) наблюдалось у растений, инокулированных патогенами и Streptomyces A1RT, по сравнению с растениями, подвергавшимися только воздействию патогенов CS. Однако между экспериментами, проведенными в марте и сентябре, не наблюдалось существенной разницы ( p > 0,05).

РИСУНОК 7. Графическое представление эффектов стимуляции роста растений (A) : Увеличение роста клубней наблюдалось при использовании Streptomyces A1RT с различными патогенами CS. (B) Рост побегов и корней в сентябре (C) Рост побегов и корней в марте. Планки погрешностей, представляющие среднее значение ± стандартное отклонение от трех повторов. Буквы над столбиками указывают на значительные различия между видами лечения, рассчитанными с помощью теста множественного диапазона Дункана (DMRT).

Обсуждение

История борьбы с почвенными патогенами с использованием Streptomyces spp. в качестве средств биоконтроля более 50 лет. Помимо конкуренции питательных веществ, Streptomyces spp.имеют несколько механизмов, которые можно использовать для борьбы с почвенными патогенами, включая производство антибиотиков, деградационных ферментов и закиси азота (Cohen and Mazzola, 2006; Mahmoudi et al., 2011). Среди них борьба с болезнями путем производства антибиотиков оставалась активной и наиболее многообещающей стратегией. Кроме того, Streptomyces spp. обладают потенциалом в качестве микроорганизмов, способствующих росту растений, для увеличения ресурсов углерода и азота и эффективной конкуренции в ризосфере (Schlatter et al., 2008). Следовательно, конечная выгода от использования бактерий, способствующих росту растений, заключается не только в подавлении болезней или усилении факторов роста растений, но и в развитии устойчивых методов ведения сельского хозяйства. Этот последний фактор особенно важен в развивающихся странах, таких как Пакистан, где для производства картофеля используется почти 250 кг азота и по 150 кг фосфора и поташа на гектар (Naqqash et al., 2016). С этой целью мы сообщаем о выделении штамма Streptomyces A1RT из почвы, подавляющей поле, где симптомы болезни CS были незначительны в течение 5 лет.

Бактерии, способствующие болезням CS, представляют собой растущую угрозу для посевов картофеля. Хотя S. scabies является наиболее известным возбудителем болезни CS, сообщалось, что S. turgidiscabies также имеет гены, связанные с патогенностью, которые кодируют продукцию фитотоксина такстомина А. Хотя S. turgidiscabies демонстрирует высокий уровень сходство последовательностей с S. scabies (Kers et al., 2005), оба вида различны (Miyajima et al., 1998). Причем S.Сообщалось, что turgidiscabies представляет собой большую угрозу CS с точки зрения характеристик роста, вирулентности и способности расти даже во влажных условиях окружающей среды (Hiltunen et al., 2009). Такие особенности породили гипотезу о том, что S. turgidiscabies может развиваться как новый патоген растений и приобрели решающие патогенные факторы от S. scabies (Loria et al., 2006). Предыдущие данные также предполагают, что из-за универсальности и приспособляемости S. turgidiscabies к различным условиям окружающей среды, возможно, что S.turgidiscabies вытеснит S. scabies из окружающей среды в будущем. Следовательно, важно найти антагонистические организмы, которые действуют против этого появляющегося патогена CS. В прошлых исследованиях такие виды бактерий, как Bacillus spp. (Han et al., 2005), Pseudomonas spp. (Arseneault et al., 2013), S. albidoflavus (Hayashida et al., 1989) и S. diastatochromogenes (Neeno-Eckwall et al., 2001) были использованы в качестве биологического контроля CS картофеля.Аналогично, Streptomyces spp. были использованы в качестве агентов биологической борьбы против S. scabies (Prévost et al., 2006) и S. turgidiscabies (Hiltunen et al., 2009). Однако, насколько нам известно, Streptomyces A1RT является первым примером биологического контроля, который активен против S. scabies и S. turgidiscabies , а также патогенов CS S. europaeiscabiei и S. stelliscabiei .

Известно, что гормон, способствующий росту растений, ИУК играет решающую роль в скорости прорастания и развитии корней и побегов (Fatima et al., 2009). В этом исследовании мы демонстрируем, что Streptomyces A1RT обладает способностью продуцировать высокие уровни ИУК. Соответственно, клубни картофеля, обработанные Streptomyces A1RT, развивались лучше с точки зрения удлинения корней, количества побегов и веса клубней. Таким образом, Streptomyces A1RT является новинкой по своей способности не только подавлять множественные патогены CS, но и способствовать росту клубней картофеля.

Испытания

в теплице, проведенные с использованием патогенных штаммов CS, показали, что заболевание CS подавлялось в горшках, когда присутствовало Streptomyces A1RT.Это может быть связано с производством соединения антибиотика Streptomyces A1RT. Анализы дисковой диффузии ясно показали, что высокоактивное соединение (или соединения) продуцируется Streptomyces A1RT. Известное соединение, продуцируемое Streptomyces A1RT, было очищено, и спектроскопически показано, что это Isatropolone C.Изатрополон C был недавно обнаружен как метаболит Streptomyces Gö66, и было показано, что он обладает антипаразитарной активностью (Cai et al., 2017). В нашем исследовании мы сообщаем, что экстракт, содержащий Isatropolone C, демонстрирует высокую антибиотическую активность.

Таким образом, главная цель 21 века - развитие экологически чистого и устойчивого сельского хозяйства. Это исследование выявило новый штамм Streptomyces A1RT как многообещающий и эффективный метод биологической борьбы с множеством патогенов CS, одновременно способствуя росту растений.

Авторские взносы

AS провела все экспериментальные работы.ZL оказала помощь в анализе данных. SZ и JZ выполнили стадии хроматографии и ЯМР-анализ. DZ и AB помогали с экспериментальным дизайном и написанием рукописи.

Финансирование

Это исследование было поддержано правительством Пакистана и Фрайбургским университетом. Мы с благодарностью выражаем благодарность Роберту С. Макнамаре Всемирному банку и Комиссии по высшему образованию Пакистана (IRSIP-1-8 / HEC / HRD / 2016/5915) за предоставление финансирования и возможность посещения Германии.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим доктора Халеда Аттия Шаабана Махмуда (Университет Кентукки, США) за помощь в выяснении структуры ЯМР и доктора Юргена Леймингера (Фрайзинг, Германия) за предоставленную техническую поддержку и положительные штаммы. Мы также благодарим доктора Jianjun Hao (Университет штата Мэн, США) за рецензирование рукописи. Благодарим Университет Пенджаба, Лахор, Пакистан, и Университет Фрайбурга, Германия, за предоставление доступа к ЯМР и лабораториям для проведения всех исследовательских работ.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.01126/full#supplementary-material

Список литературы

Аббас, М. Т., Хамза, М. А., Юссеф, Х. Х., Юссеф, Г. Х., Файез, М., Мониб, М., и др. (2014). Биопрепараты поддерживают продуктивность картофеля, выращенного в условиях пустыни на севере Синая: пять лет полевых испытаний. J. Adv. Res. 5, 41–48. DOI: 10.1016 / j.jare.2012.11.004